一、实验原理

病毒空斑实验主要基于病毒的感染和复制机制，当单个病毒感染细胞后，由于固体培养基的限制，病毒裂解细胞释放只能向周围细胞扩散。经过几个复制周期，便形成一个局限性病变细胞区，结晶紫使活细胞呈紫色，而病变区细胞由于裂解死亡无法染色，形成空斑。通过观察空斑，可以揭示病毒的传播途径、寄主范围和致病机制。

二、实验步骤（以流感病毒感染MDCK细胞为例）

1．细胞铺板：MDCK细胞接种6孔板，2*10^6个细胞/孔。置于37℃，5%CO2培养箱培养48h。

2．病毒稀释：将病毒液用MEM（不含血清）按照10倍的梯度进行稀释，从10^ -1至10^ -8。

3．病毒接种：弃去细胞旧培养液，用PBS洗涤一次。每块6孔板设置两个对照组，每个浓度梯度设置两个实验组。对照组加入MEM，实验组每孔加入病毒稀释液1mL，置于35℃，5% CO2培养箱孵育1h。

4．配制2%琼脂培养基：A液：1g琼脂糖与50mL PBS溶液混合加热，使琼脂糖充分溶解，将温度降至70℃，待用。B液：准备37℃ MEM培养基50mL。

5．病毒固定：将A液和B液混合，加入1µg/mL TPCK-trypsin混匀；弃去病毒孵育液，每孔加入AB混合液2 mL；待其凝固后将6孔板倒扣放置35℃，5%CO2培养箱72h。培养完成后，每孔加入2mL的4%多聚甲醛固定液进行固定，时间大于4h。

6．空斑固定染色：去除甲醛固定液，去除6孔板中的固体琼脂培养基，用结晶紫染色液染色1 h，将多余的染色液冲洗干净，倒扣晾干。

7．计算空斑数（PFU/mL）：选择斑块清晰、不重叠、数量适中的孔，数出斑块数量，用以下公式进行计算。

三、注意事项

1．细胞铺板需要均匀，采用十字或八字摇法使细胞分布均匀，细胞培养完成后利用显微镜观察单层细胞密度是否达100%。

2．对病毒原液稀释时，需设置合理的梯度，在最低稀释度下，过多的感染性病毒粒子会破坏大片的单层细胞，或者产生过多且重叠的无法识别的空斑。

3．病毒孵育需用不含血清培养基。

4．琼脂糖半固体必须加入TPCK-trypsin，否则病毒无法进入细胞，形成噬斑。

5．将琼脂糖半固体加入孔板中，需注意琼脂糖温度。50℃左右最适宜，太高易导致细胞死亡，太低琼脂糖易凝固。

6．去除琼脂糖培养基时，注意避免刮到细胞，影响结果判断。

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